UTILISATION DU SPERME EPIDIDYMAIRE EN VUE DE LA MISE EN PLACE D’UNE BANQUE GÉNÉTIQUE

Abstract

Abstract The objective of our project is to contribute to the field of cryopreservation of epididymal sperm and to define the particularities of species in order to facilitate the successful completion of cryopreservation and the establishment of a cryogenic bank of local animal populations threatened with extinction, by the growing infusion of more efficient exotic breeds or those threatened by environmental factors. Three aspects were addressed before contributing to the creation of a national epididymal sperm bank: The first experiment was to examine for the first time the characteristics and preservation of post-mortem spermatozoa, obtained from the epididymis and vas deferens of adult roosters from the local population. Compare the quality of sperm at the level of the epididymis and the vas deferens. To determine the effectiveness of two post-mortem sperm collection techniques and the effect of in situ storage at different temperatures (2h and 24h at 20 ° C and after refrigeration at 4 ° C for 24h). The second experiment madeit possible to evaluate the quality in pre-freezing and post-freezing of the epididymal sperm of the local goat, as a function of the storage temperature of the testes, and the time elapsed between the death of the animal and the recovery of the sperm (0, 24, 48.72 h), to establish the optimal protocols for cryopreservation of epididymal sperm in this species. In a third part, a comparison of the effect of 5 µg / ml of three antioxidants in the local bull epididymal sperm freezing diluent: Quercetin, trolox and tannic acid. According to the results obtained, it can be concluded that good quality semen samples can be collected from the vas deferens with the flushing method, and that the local rooster sperm can be stored in situ at 20°C for 24 hours without change of sperm quality. Room temperature (21.5°C) and refrigeration (4°C) allow maintaining up to 48 hours after death, a very good quality of goat epididymal semen before freezing. Cryopreservation of the goat's epididymal sperm stored in situ for 48 hours at 4 ° C did not significantly influence the sperm parameters: motility, progressive mobility, viability, acrosomal integrity, integrity of the sperm. Membrane and the rate of abnormalities. The addition of the antioxidants to the diluents demonstrated that there is a large significant difference (p <0.001) between the control and the other antioxidants while there is no difference between the three antioxidants. With better values in the two-dilution media with trolox and quercetin for all values in the bovine species. Finally, 1879 doses of sperm were stored with 41 donors of local breeds (cattle, goats, sheep, and roosters) as a first step in the establishment of an epididymal sperm genetic bank. The difficulties encountered and the recommendations for the success of our project to set up a cryobank for local animal populations are presented.

--------------------------------------------------------- Résumé L'objectif de notre projet est de contribuer au domaine de la cryoconservation du sperme épididymaire et de définir les particularités d’espèces pour faciliter l’aboutissement de la cryoconservation et la mise en place d’une banque cryogénique des populations animales locales menacées de disparition par l’infusion croissante de races exotiques plus performantes ou celles menacées par les facteurs environnementaux. Trois volets ont été abordés avant de contribuer à la création d’une banque nationale de sperme épididymaire : La première expérimentation était d'examiner pour la première fois les caractéristiques et la conservation des spermatozoïdes post-mortem, obtenus à partir de l'épididyme et du canal déférent de coqs adultes de population locale. Comparer la qualité du sperme au niveau de l'épididyme et du canal déférent. Déterminer l'efficacité de deux techniques de prélèvement de sperme post-mortem et l’effet de la conservation in situ à différentes températures (2h et 24h à 20°C et après réfrigération à 4°C pendant 24h). La deuxième expérience a permis d'évaluer la qualité en pré congélation et en post congélation du sperme épididymaire du bouc local en fonction de la température de stockage des testicules et du temps écoulé entre la mort de l’animal et la récupération du sperme (0, 24, 48,72 h), pour établir les protocoles optimaux de la cryoconservation du sperme épididymaire dans cette espèce. Un troisième volet, une comparaison de l’effet de l'inclusion de 5 µg /ml de trois antioxydants dans le dilueur de congélation de sperme épididymaire de taureau locale : La quercétine, le trolox et l’acide tannique. Selon les résultats obtenus, on peut conclure que des échantillons de sperme de bonne qualité peuvent être collectés à partir du canal déférent avec la méthode de rinçage, et que le sperme chez le coq local peut être conservé in situ à 20°C pendant 24h sans altération de la qualité spermatique. Chez le bouc local, la température ambiante (21.5°C) et de réfrigération (4°C) des spermatozoïdes, permettent de maintenir jusqu’à 48 heures après la mort, une très bonne qualité de sperme épididymaire de bouc avant sa congélation. La cryoconservation du sperme épididymaire de bouc, conservé in situ pendant 48h à 4°C n’a pas influencé d’une façon significative les paramètres spermatiques : la motilité, la mobilité progressive, la viabilité, l’intégrité acrosomique, l’intégrité de la membrane et le taux d’anomalies. L’ajout des antioxydants aux dilueurs a démontré qu’il existe une grande différence significative (p<0.001) entre le témoin et les autres antioxydants alors qu’il n'y a pas de différences entre les trois antioxydants. Avec des valeurs meilleures dans les deux milieux de dilution avec le trolox et la quercétine pour l’ensemble des valeurs chez l’espèce bovine. Finalement un total de 1879 doses de sperme, a été cryoconservé auprès d'un total de 41 donneurs de races locales (bovins, caprins, ovins, coqs) comme première démarche pour la mise en place d’une banque génétique de sperme épididymaire. Les difficultés rencontrées et les recommandations pour faire aboutir notre projet de mettre sur pied une cryobanque pour les populations animales locales sont présentées. ------------------------------------------------------- الملخــــــــص الهدف من مشروعنا هو المساهمة في مجال الحفظ بالتبريد للحيوانات المنوية البربخية وتحديد خصائص الأنواع لتسهيل إكمال الحفظ بالتبريد بنجاح وإنشاء بنك مبرد لأعداد من الحيوانات المحلية المهددة بالانقراض، السلالات الغريبة الأكثر كفاءة أو تلك المهددة بالعوامل البيئية. تمت مناقشة ثلاثة جوانب قبل المساهمة في إنشاء بنك وطني للحيوانات المنوية البربخية: كانت التجربة الأولى هي فحص خصائص الحيوانات المنوية بعد الوفاة التي تم الحصول عليها من البربخ والأسهر من الديوك البالغة من السكان المحليين والحفاظ عليها لأول مرة. قارنا بين جودة الحيوانات المنوية على مستوى البربخ والأسهر. لتحديد فعالية جمع الحيوانات المنوية بعد الذبح وتأثير التخزين في الموقع في درجات حرارة مختلفة (ساعتان و24 ساعة عند 20 درجة مئوية وبعد التبريد عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة). أتاحت التجربة الثانية تقييم جودة الحيوانات المنوية البربخية للماعز المحلي في مرحلة ما قبل التجميد وما بعد التجميد بدلالة درجة حرارة تخزين الخصيتين والوقت المنقضي بين موت الحيوان وانتعاشه. (0،24، 48.72 ساعة)، وإنشاء البروتوكولات المثلى للحفاظ بالتبريد على الحيوانات المنوية البربخية في هذا النوع. في الجزء الثالث، مقارنة تأثير تضمين 5 ميكروغرام / مل من ثلاثة مضادات أكسدة في مخفف تجميد الحيوانات المنوية البربخ المحلي: كيرسيتين،ترولوكس وحمض التانيك. وفقًا للنتائج التي تم الحصول عليها، يمكن استنتاج أنه يمكن جمع عينات من السائل المنوي ذات نوعية جيدة من الأسهر باستخدام طريقة التنظيف، وأنه يمكن تخزين الحيوانات المنوية المحلية في مكانها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة دون تغييرفي جودته. تسمح درجة حرارة الغرفة (21.5 درجة مئوية) والتبريد (4 درجات مئوية) بالحفاظ لمدة تصل إلى 48 ساعة بعد الموت، وهي نوعية جيدة جدًا من السائل المنوي للماعز قبل التجميد. لم يؤثر الحفظ بالتبريد للحيوانات المنوية البربخية للماعز المخزنة في الموقع لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية بشكل كبير على معاملات الحيوانات المنوية: الحركة، والتنقل التدريجي،والحيوية، وسلامة الحيوانات المنوية، ومعدل التشوهات. أظهرت إضافة مضادات الأكسدة إلى المخففات أن هناك فرقًا كبيرًا معنويًا (p <0.001) بين مجموعة التحكم ومضادات الأكسدة الأخرى بينما لا يوجد فرق بين مضادات الأكسدة الثلاثة. مع قيم أفضل في وسطي التخفيف مع ترولوكسوكيرسيتين لجميع القيم في أنواع الأبقار. أخيرًا، تم تخزين مجموعه 1879 جرعة من الحيوانات المنوية مع مجموعه 41 متبرعًا من السلالات المحلية كخطوة أولى في إنشاء بنك جيني للحيوانات المنوية البربخية. يتم عرض الصعوبات التي تمت مواجهتها والتوصيات الخاصة بنجاح مشروعنا لإنشاء بنك تجميد للحيوانات المحلية.